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DETERMINACIÓN ANALÍTICA DE HDL COLESTEROL
Marco teórico
El hígado es el centro del metabolismo de los lípidos. Elabora alrededor del 80% del colesterol en
el organismo. El hígado puede
sintetizar, almacenar y exportar triglicéridos.
Para controlar la concentración de colesterol y triglicéridos del
organismo, el hígado emsambla, secreta y
capta algunas partículas de lipoproteínas.
Algunas de estas, las VLDL distribuyen lípidos al tejido adiposo para su
almacenamiento como grasa o a otros tejidos para su uso inmediato. En el transcurso de estas funciones, las VLDL
sufren pérdida de sus componentes lipídicos y proteínicos, produciéndose como
resultado las LDL que son devueltas al hígado.
Otras partículas, las HDL se sintetizan y secretan en el hígado para
depurar el exceso de colesterol y triglicéridos de otros tejidos y del torrente
circulatorio, retornándolos al hígado para su excreción.
Por electroforesis, estas lipoproteínas se pueden agrupar
en:
- Quilomicrones:
Son fundamentalmente triglicéridos.
- LDL:
Compuestas sobretodo de colesterol.
- VLDL:
Son principalmente triglicéridos.
- HDL:
Compuestas básicamente por proteínas.
Además de eliminar colesterol de los tejidos, las HDL pueden tener un
efecto protector al evitar que las células capten el colesterol y los
lípidos. Estas
acciones potenciales explican el efecto cardiovascular protector de las
HDL. La relación HDL/colesterol total,
debe ser por lo menos de 1:5 y se considerándose ideal una cifra de 1:3.
Los niveles altos de HDL se asocian con menor riesgo de enfermedad
coronaria, mientras que niveles elevados de LDL y VLDL se asocian con un
mayor riesgo de enfermedad oclusiva
coronaria. Los niveles de HDL se
incrementan en pacientes que realizan actividad física frecuente o en los que
sólo consumen cantidades moderadas de alcohol.
Por otra parte, se sabe que las LDL y VLDL aumentan en personas con
malos hábitos dietéticos (consumo
habitual de grasas animales y alimentos preparados). Sin embargo, se cree que la constitución
genética es el principal determinante del nivel de lipoproteínas.
Objetivo:
Aplicar la fundamentación teórica adquirida para la realización de un método indirecto mediante la determinación analítica de HDL colesterol y su correcta interpretación clínicopatológica.
Aplicar la fundamentación teórica adquirida para la realización de un método indirecto mediante la determinación analítica de HDL colesterol y su correcta interpretación clínicopatológica.
Métodos de separación de proteínas
- Ultracentrifugación
- Electroforesis
- Precipitación polianiónica
Método: enzimático colorimétrico
Precipitación de lipoproteínas
Fundamento del método:
Las VLDL y las LDL presentes en la muestra, precipitan en
presencia de fosfotungstato e iones magnesio.
El sobrenadante contiene las HDL
cuyo colesterol se cuantifica fotométricamente mediante las siguientes reacciones:
Colesterol esterificado + H2O
Col esterasa
Colesterol + Ac. Graso
Colesterol +1/2 O2
+ H2O Col.
Oxidasa
Colestenona + H2O2
2H202 + 4
Aminoantipirina + Fenol Peroxidasa
Quinonaimina + 4 H2O
Muestras
Suero o plasma recogidos mediante procedimientos estándar
Estabilidad de la muestra:
El colesterol HDL en suero o plasma, es estable 7 días a 2
– 8 ºC
Interferentes
Los anticoagulantes como la heparina, EDTA, oxalato o fluoruro, no interfieren.
El ácido ascórbico, la Bb y la
Hb sí interfieren.
Procedimiento:
Precipitación:
Pipetear en un tubo de
centrífuga:
0.2 mL de muestra
0.5 mL
Agitar fuertemente
Dejar en reposo por 10 minutos
a Tº ambiente.
Centrifugar 10 minutos a 3000
RPM
Colorimetría
Atemperar el Reactivo a
Tº ambiente
Pipetear en tubos de
ensayo:
100 uL de sobrenadante de
muestra 100 uL de estándar
Agregar 1 mL de reactivo
de color
Mezclar
Incubar 30 minutos a Tº
ambiente o 10 minutos a 37 ºC
Leer la Absorbancia
frente al blanco de reactivo
Estabilidad de la reacción: 30 minutos.
Unidades SI: mmol/L
mg/dL de HDL
Colesterol x 1.36 =
mmol/L de HDL colesterol
Correlación Clínicopatológica
Hiperalfalipoproteinemia familiar:
Algunas familias presentan
concentraciones de HDL aumentadas, de
carácter hereditario ( autosómico dominante).
Esta característica va asociada a longevidad y a disminución de riesgo
de ECV.
Enfermedad de Tangier:
En una enfermedad poco frecuente, caracterizada por una deficiencia de HDL
plasmática y acumulación de células cargadas de ésteres de colesterol en el
retículo endotelial. Frecuentemente
presentan aterosclerosis prematura.
Niveles Aumentados
- Actividad física frecuente
- Consumo moderado de alcohol
Niveles disminuidos:
- Sedentarismo
- Cigarrillo
- Consumo de grasas
- Consumo de alcohol
DETERMINACIÓN ANALÌTICA DE COLESTEROL TOTAL
Marco teórico:
El colesterol es
un aAlcohol esteroide no saturado. Es un
importante componente estructural de las membranas celulares y un precursor
para la biosíntesis de los ácidos biliares
y las hormonas esteroideas. 2/3
del colesterol en plasma están esterificados con cadenas largas saturadas y
ácidos grasos no saturados, y 1/3 existe en forma de colesterol no
esterificado.
Las
concentraciones de colesterol se elevan con la edad desde el principio de la
edad adulta en ambos sexos. Las mujeres
tienen niveles más bajos que los varones, excepto en la niñez y después de los
50 años.
La ingestión de
grasas saturadas y colesterol con la dieta tiene una influencia importante
sobre los niveles de colesterol en sangre, tardando los efectos de 1 a 2
semanas para ponerse de manifiesto. Para
comprobar el nivel habitual de colesterol en una persona es importante que se
mantenga con su dieta habitual durante las 2 últimas semanas y que no gane ni
pierda peso.
Objetivo: Conocer el fundamento teórico para realizar medición
analítica de colesterol total y su correcta interpretación clínica
Condiciones del
paciente
No requiere ayuno
previo.
Muestra: Suero o plasma con EDTA, heparina, oxalato o fuoruro.
Estabilidad de la
muestra: La muestra es estable 7 días a 2 -
8 ºC.
Método: Enzimático - Colorimétrico.
Fundamento del
método: Tanto el colesterol libre como el
esterificado presentes en la muestra originan, según las reacciones acopladas
descritas a continuación un complejo coloreado que se cuantifica por
espectrofotometría.
Colesterol
esterificado Col. Esterasa
Colesterol + Ac. graso
Col + 1/2 02 Col. Oxidasa Colestenona + H202
2 H202
+ 4 aminoantipirina + fenol Peroxidasa
Quinonaimina + 4 H20
Procedimiento: Dejar atemperar el reactivo de trabajo
durante unos minutos a temperatura ambiente.
Pipetear en tubos
de ensayo:
Muestra Patrón
Patrón
colesterol
|
|
10 uL
|
|
Muestra
|
10 uL
|
|
10 uL
|
Reactivo de
color
|
1.0 mL
|
1.0 mL
|
1.0 mL
|
- Agitar bien e incubar durante 10' a temperatura ambiente o durante 5' a 37ºC.
- Leer la Absorbancia del patrón y de la muestra frente al blanco de Reactivo a 500 nm.
Cálculo: A muestra x 200
= mg/dL de
A Patrón colesterol
Valores de
referencia: Hasta 200 mg/dL. Estos valores se dan a título orientativo, es
recomendable que cada laboratorio establezca sus propios intervalos de
referencia.
Las
concentraciones de colesterol en sangre se han interpretado clásicamente sobre
la base de unos márgenes normales definidos a partir de niveles de colesterol
medidos en poblaciones normales. Sin
embargo, se ha aceptado desde hace mucho tiempo que el riesgo cardiovascular es
una función continua de la concentración de colesterol y que los individuos
situados en el límite superior del margen normal tienen un riesgo mayor que los
que están situados en el límite inferior.
Linealidad del
método: Hasta 1000 mg/dL.
Interferencias: el ácido ascórbico, la Hemoglobina y la
bilirrubina interfieren en el ensayo. La
lipemia no afecta los resultados.
Para las
mediciones de colesterol se acepta un % de inexactitud + 5% y un CV +
5%, aunque el Laboratory Standardization Panel of the National Cholesteroll
Education Program recomienda que tanto la imprecisión como la inexactitud para
medir colesterol deben ser reducidas a + 3%.
Los
métodos enzimáticos se ven menos sujetos a posibles interferencias por
sustancias no esterólicas que los métodos químicos. No obstante, no poseen absoluta especificidad
para el colesterol, dado que su Oxidasa puede reaccionar con otros esteroles
que se saben que están también presentes en el plasma.
Niveles
Aumentados:
§ Hipotiroidismo
§ Diabetes Mellitus descontrolada
§ Síndrome nefrótico
§ Embarazo
§ Hipertensión
§ Infarto de miocardio
§ Aterosclerosis
§ Cirrosis biliar
§ Estrés
§ Nefrosis
Niveles
disminuidos:
§ Malabsorción
§ Desnutrición
§ Hipertiroidismo
§ Anemia perniciosa
§ Anemia
§ Sepsis
§ Estrés
§ Enfermedad hepática
DETERMINACION ANALITICA DE TRIGLICERIDOS
Marco
teórico:
Los
triglicéridos son ésteres formados por glicerina y ácidos grasos de cadena
larga.
Constituyen
alrededor de un 25% del peso del tejido adiposo y son la principal forma de
almacenamiento de lípidos en el hombre.
Los triglicéridos son transportados en el plasma en su mayor parte en
forma de quilomicrones y VLDL, pero están también presentes en menor cantidad
en LDL y HDL.
Los
triglicéridos pueden ser de origen exógeno que son los que suministramos al
organismo al ingerir grasas saturadas, y endógenos que son los que fabrica el
hígado en su proceso fisiológico al degradar los exógenos.
Objetivo:
Realizar la medición analítica de triglicéridos e interpretar
correctamente los resultados, teniendo en cuenta la fundamentación teórica
adquirida.
Condiciones
del paciente: Requiere ayuno mínimo de 12 horas. Esto se debe a que en el plasma posprandial
hay habitualmente presentes quilomicrones, y según el tipo y cantidad de
alimento ingerido, puede aumentar marcadamente la concentración de
triglicéridos en el suero. Los
quilomicrones con eliminados en pocas horas y su presencia después de un ayuno
de 12 horas no es normal.
Condiciones
de la muestra:
Suero
o Plasma.
Los
anticoagulantes como heparina, EDTA, oxalato o fluoruro, NO interfieren.
Estabilidad
de la muestra: 5 Días a 2 - 8 ºC.
Método:
Enzimático - Colorimétrico: Estos
métodos para determinar triglicéridos son relativamente específicos, rápidos y
fáciles de usar y no están sujetos a interferencias por fosfolípidos o
glucosa. Sin embargo, no todos los
métodos enzimáticos funcionan de igual manera, y algunos varían tanto en su
precisión que presentan CV hasta del 10%.
Por tanto, antes de seleccionar un método enzimático es aconsejable
evaluar su precisión utilizando las concentraciones de triglicéridos que se
hallan con mayor frecuencia, es decir, entre 50 - 500 mg/dL.
Fundamento
del método:
Los
triglicéridos presentes en la muestra, originan según las reacciones acopladas
descritas a continuación, un complejo coloreado que se cuantifica por
espectrofotometría:
Triglicéridos
+ H2O lipasa Glicerol
+ Acidos grasos
Glicerol
+ ATP Glicerol quinasa Glicerol - 3-P + ADP
Glicerol-3-P
+ O2 G 3P- Oxidasa Dihidroacetona-P + H2O2
2
H2O2 + 4- Aminoantipirina
+ 4 Clorofenol Peroxidasa Quinonaimina
+
4 H2O.
Procedimiento:
-
Dejar
atemperar el reactivo durante unos minutos a temperatura ambiente.
-
Pipetear
en tubos de ensayo:
|
Patrón
|
Muestra
|
Patrón
|
10
uL
|
|
Muestra
|
|
10
uL
|
Rvo.
color
|
1
mL
|
1
mL
|
Agitar
bien e incubar 15' a temperatura ambiente o durante 5' a 37ºC.
Leer
contra blanco de reactivo a 500 nm.
El
color es estable al menos por 2 horas.
*Valores
de Referencia: 50 - 150 mg/dL (
BIOSYSTEMS ).
Estos
valores se dan a título orientativo. Se
recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de Referencia.
Linealidad: Hasta 600 mg/dL.
Interferencias:
-
El ácido
ascórbico.
-
La
hemoglobina.
-
La
Bilirrubina.
La
lipemia no afecta los resultados.
·
Los
valores de referencia fluctúan entre 45 y 170 mg/dL según la edad y el método utilizado.
Es
conveniente no tener concentraciones de triglicéridos en exceso, pues este
excedente es el primer eslabón en las alteraciones lipoproteicas que originan
una de las principales causas de muerte con sus manifestaciones
cardiovasculares.
Dianas
de trigliceridos:
Existen
algunas sustancias no glicéridas que pueden añadirse a la medición de
triglicéridos como ocurre con el
glicerol libre, por ejemplo. El glicerol
está normalmente en el plasmaa en concentraciones inferiores a 1.5 mg/dl, pero
puede aumentar en diabéticos no controlados, tras un ejercicio vigoroso. Tras la ingesta de algunos medicamentos que
contienen glicerol o por contaminación casual con el glicerol utilizado como
lubricante en los tapones de algunos tubos de ensayo.
En
el plasma o suero frescos están generalmente presentes glicéridos parciales en
muy baja concentración, pero pueden formarse por la hidrólisis lenta de los
triglicéridos cuando se almacenan las muestras.
Afortunadamente
el problema de las dianas suele ser de poca importancia práctica y, rutinariamente no se determinan en los
laboratorios debido a que la magnitud de las dianas encontradas en la mayoría
de las muestras frescas es alrededor de 5 mg/dL.