Guías de laboratorio para la práctica del martes y miércoles

Buenos días:  estas son las guías para las próximas prácticas. Por favor, lean la programación para que conozcan cuándo las haremos.

Felicidades

DETERMINACIÓN ANALÍTICA DE HDL COLESTEROL

Marco teórico

El hígado es el centro del metabolismo de los lípidos.  Elabora alrededor del 80% del colesterol en el organismo.  El hígado puede sintetizar, almacenar y exportar triglicéridos. 

Para controlar la concentración de colesterol y triglicéridos del organismo, el hígado emsambla,  secreta y capta algunas partículas de lipoproteínas.  Algunas de estas, las VLDL distribuyen lípidos al tejido adiposo para su almacenamiento como grasa o a otros tejidos para su uso inmediato.  En el transcurso de estas funciones, las VLDL sufren pérdida de sus componentes lipídicos y proteínicos, produciéndose como resultado las LDL que son devueltas al hígado.   Otras partículas, las HDL se sintetizan y secretan en el hígado para depurar el exceso de colesterol y triglicéridos de otros tejidos y del torrente circulatorio, retornándolos al hígado para su excreción.

Por electroforesis, estas lipoproteínas se pueden agrupar en:

• Quilomicrones:  

Son fundamentalmente triglicéridos.

• LDL:

Compuestas sobretodo de colesterol.

• VLDL:

Son principalmente triglicéridos.

• HDL:

Compuestas básicamente por proteínas.

Además de eliminar colesterol de los tejidos, las HDL pueden tener un efecto protector al evitar que las células capten el colesterol y los lípidos.  Estas

acciones potenciales explican el efecto cardiovascular protector de las HDL.  La relación HDL/colesterol total, debe ser por lo menos de 1:5 y se considerándose ideal una cifra de 1:3.

Los niveles altos de HDL se asocian con menor riesgo de enfermedad coronaria, mientras que niveles elevados de LDL y VLDL se asocian con un mayor  riesgo de enfermedad oclusiva coronaria.  Los niveles de HDL se incrementan en pacientes que realizan actividad física frecuente o en los que sólo consumen cantidades moderadas de alcohol.  Por otra parte, se sabe que las LDL y VLDL aumentan en personas con malos hábitos dietéticos  (consumo habitual de grasas animales y alimentos preparados).  Sin embargo, se cree que la constitución genética es el principal determinante del nivel de lipoproteínas.

Objetivo:
Aplicar la fundamentación teórica adquirida para la realización de un método indirecto mediante la determinación analítica de HDL colesterol y su correcta interpretación clínicopatológica.

Métodos de separación de proteínas

• Ultracentrifugación
• Electroforesis
• Precipitación polianiónica

Método:   enzimático colorimétrico

Precipitación de lipoproteínas

Fundamento del método: 

Las VLDL y las LDL presentes en la muestra, precipitan en presencia de fosfotungstato e iones magnesio.  El sobrenadante contiene las HDL  cuyo colesterol se cuantifica fotométricamente mediante las siguientes reacciones:

Colesterol esterificado + H₂O Col esterasa

Colesterol + Ac. Graso

Colesterol +1/2 O₂ + H₂O  Col. Oxidasa

Colestenona + H₂O₂

2H₂0₂ + 4 Aminoantipirina + Fenol   Peroxidasa 

Quinonaimina + 4 H₂O

 

Muestras

Suero o plasma recogidos mediante procedimientos estándar

Estabilidad de la muestra:

El colesterol HDL en suero o plasma, es estable 7 días a 2 – 8 ºC

 

Interferentes

Los anticoagulantes como la heparina, EDTA, oxalato o fluoruro,  no interfieren.

El ácido ascórbico, la Bb y la Hb sí interfieren.

Procedimiento: 

Precipitación:

Pipetear en un tubo de centrífuga:

0.2 mL de muestra

0.5 mL

Agitar fuertemente

Dejar en reposo por 10 minutos a Tº ambiente.

Centrifugar 10 minutos a 3000 RPM

 

Colorimetría

Atemperar el Reactivo a Tº ambiente

Pipetear en tubos de ensayo:

100 uL de sobrenadante de muestra 100 uL de estándar

Agregar 1 mL de reactivo de color

Mezclar

Incubar 30 minutos a Tº ambiente o 10 minutos a 37 ºC

Leer la Absorbancia frente al blanco de reactivo

Estabilidad de la reacción:  30 minutos.

Unidades SI:  mmol/L

mg/dL de HDL Colesterol   x  1.36  = mmol/L de HDL colesterol

Correlación Clínicopatológica

Hiperalfalipoproteinemia familiar:

Algunas familias presentan concentraciones de HDL aumentadas, de carácter hereditario ( autosómico dominante).  Esta característica va asociada a longevidad y a disminución de riesgo de ECV.

Enfermedad de Tangier:

En una enfermedad poco frecuente, caracterizada por una deficiencia de HDL plasmática y acumulación de células cargadas de ésteres de colesterol en el retículo endotelial.  Frecuentemente presentan aterosclerosis prematura.

Niveles Aumentados

• Actividad física frecuente
• Consumo moderado de alcohol

Niveles disminuidos:

• Sedentarismo
• Cigarrillo
• Consumo de grasas
• Consumo de alcohol  
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DETERMINACIÓN ANALÌTICA DE COLESTEROL TOTAL

Marco teórico:

El colesterol es un aAlcohol esteroide no saturado.  Es un importante componente estructural de las membranas celulares y un precursor para la biosíntesis de los ácidos biliares  y las hormonas esteroideas.  2/3 del colesterol en plasma están esterificados con cadenas largas saturadas y ácidos grasos no saturados, y 1/3 existe en forma de colesterol no esterificado. 

Las concentraciones de colesterol se elevan con la edad desde el principio de la edad adulta en ambos sexos.  Las mujeres tienen niveles más bajos que los varones, excepto en la niñez y después de los 50 años.

La ingestión de grasas saturadas y colesterol con la dieta tiene una influencia importante sobre los niveles de colesterol en sangre, tardando los efectos de 1 a 2 semanas para ponerse de manifiesto.  Para comprobar el nivel habitual de colesterol en una persona es importante que se mantenga con su dieta habitual durante las 2 últimas semanas y que no gane ni pierda peso.

Objetivo:  Conocer el fundamento teórico para realizar medición analítica de colesterol total y su correcta interpretación clínica

Condiciones del paciente

No requiere ayuno previo.

Muestra:  Suero o plasma con EDTA, heparina, oxalato o fuoruro.

Estabilidad de la muestra:  La muestra es estable 7 días a 2 - 8 ºC.

Método:  Enzimático - Colorimétrico.

Fundamento del método:  Tanto el colesterol libre como el esterificado presentes en la muestra originan, según las reacciones acopladas descritas a continuación un complejo coloreado que se cuantifica por espectrofotometría.

Colesterol esterificado      Col. Esterasa     Colesterol + Ac. graso

Col + 1/2 0₂       Col. Oxidasa    Colestenona + H₂0₂       

2 H₂0₂ + ₄ aminoantipirina + fenol     Peroxidasa      Quinonaimina + 4 H₂0

Procedimiento:  Dejar atemperar el reactivo de trabajo durante unos minutos a temperatura ambiente.

Pipetear en tubos de ensayo:

                                   Muestra        Patrón            

Patrón colesterol		10 uL
Muestra	10 uL		10 uL
Reactivo de color	1.0 mL	1.0 mL	1.0 mL

• Agitar bien e incubar durante 10' a temperatura ambiente o durante 5' a 37ºC.

• Leer la Absorbancia del patrón y de la muestra frente al blanco de Reactivo a 500 nm.

Cálculo:  A muestra    x 200  = mg/dL de

                A Patrón                    colesterol

Valores de referencia:  Hasta 200 mg/dL.  Estos valores se dan a título orientativo, es recomendable que cada laboratorio establezca sus propios intervalos de referencia.

Las concentraciones de colesterol en sangre se han interpretado clásicamente sobre la base de unos márgenes normales definidos a partir de niveles de colesterol medidos en poblaciones normales.  Sin embargo, se ha aceptado desde hace mucho tiempo que el riesgo cardiovascular es una función continua de la concentración de colesterol y que los individuos situados en el límite superior del margen normal tienen un riesgo mayor que los que están situados en el límite inferior.

Linealidad del método:   Hasta 1000 mg/dL.

Interferencias:  el ácido ascórbico, la Hemoglobina y la bilirrubina interfieren en el ensayo.  La lipemia no afecta los resultados.

Para las mediciones de colesterol se acepta un % de inexactitud + 5% y un CV + 5%, aunque el Laboratory Standardization Panel of the National Cholesteroll Education Program recomienda que tanto la imprecisión como la inexactitud para medir colesterol deben ser reducidas a + 3%.

Los métodos enzimáticos se ven menos sujetos a posibles interferencias por sustancias no esterólicas que los métodos químicos.  No obstante, no poseen absoluta especificidad para el colesterol, dado que su Oxidasa puede reaccionar con otros esteroles que se saben que están también presentes en el plasma.

Niveles Aumentados:

§  Hipotiroidismo

§  Diabetes Mellitus descontrolada

§  Síndrome nefrótico

§  Embarazo

§  Hipertensión

§  Infarto de miocardio

§  Aterosclerosis

§  Cirrosis biliar

§  Estrés

§  Nefrosis

Niveles disminuidos:

§  Malabsorción

§  Desnutrición

§  Hipertiroidismo

§  Anemia perniciosa

§  Anemia

§  Sepsis

§  Estrés

§  Enfermedad hepática

 

DETERMINACION ANALITICA DE TRIGLICERIDOS

Marco teórico:

Los triglicéridos son ésteres formados por glicerina y ácidos grasos de cadena larga.

Constituyen alrededor de un 25% del peso del tejido adiposo y son la principal forma de almacenamiento de lípidos en el hombre.  Los triglicéridos son transportados en el plasma en su mayor parte en forma de quilomicrones y VLDL, pero están también presentes en menor cantidad en LDL y HDL.

Los triglicéridos pueden ser de origen exógeno que son los que suministramos al organismo al ingerir grasas saturadas, y endógenos que son los que fabrica el hígado en su proceso fisiológico al degradar los exógenos.

Objetivo:  Realizar la medición analítica de triglicéridos e interpretar correctamente los resultados, teniendo en cuenta la fundamentación teórica adquirida.

Condiciones del paciente:  Requiere ayuno mínimo de 12 horas.  Esto se debe a que en el plasma posprandial hay habitualmente presentes quilomicrones, y según el tipo y cantidad de alimento ingerido, puede aumentar marcadamente la concentración de triglicéridos en el suero.  Los quilomicrones con eliminados en pocas horas y su presencia después de un ayuno de 12 horas no es normal.

Condiciones de la muestra:

Suero o Plasma.

Los anticoagulantes como heparina, EDTA, oxalato o fluoruro,  NO interfieren.

Estabilidad de la muestra:  5 Días a 2 - 8 ºC.

Método:  Enzimático - Colorimétrico:  Estos métodos para determinar triglicéridos son relativamente específicos, rápidos y fáciles de usar y no están sujetos a interferencias por fosfolípidos o glucosa.  Sin embargo, no todos los métodos enzimáticos funcionan de igual manera, y algunos varían tanto en su precisión que presentan CV hasta del 10%.  Por tanto, antes de seleccionar un método enzimático es aconsejable evaluar su precisión utilizando las concentraciones de triglicéridos que se hallan con mayor frecuencia, es decir, entre 50 - 500 mg/dL.

Fundamento del método:

Los triglicéridos presentes en la muestra, originan según las reacciones acopladas descritas a continuación, un complejo coloreado que se cuantifica por espectrofotometría:

Triglicéridos + H₂O  lipasa          Glicerol  + Acidos grasos

Glicerol + ATP    Glicerol quinasa     Glicerol - 3-P + ADP

Glicerol-3-P + O₂     G 3P- Oxidasa         Dihidroacetona-P + H₂O₂

2 H₂O₂ + 4- Aminoantipirina  + 4 Clorofenol   Peroxidasa     Quinonaimina 

+ 4 H₂O.

Procedimiento:

-          Dejar atemperar el reactivo durante unos minutos a temperatura ambiente.

-          Pipetear en tubos de ensayo:

	Patrón	Muestra
Patrón	10 uL
Muestra		10 uL
Rvo. color	1 mL	1 mL

Agitar bien e incubar 15' a temperatura ambiente o durante 5' a 37ºC.

Leer contra blanco de reactivo a 500 nm.

El color es estable al menos por 2 horas.

*Valores de Referencia:  50 - 150 mg/dL     (  BIOSYSTEMS ).

Estos valores se dan a título orientativo.   Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de Referencia.

Linealidad:  Hasta 600 mg/dL.

Interferencias:  

-          El ácido ascórbico.

-          La hemoglobina.

-          La Bilirrubina.

La lipemia no afecta los resultados.                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                

·         Los valores de referencia fluctúan entre 45 y 170 mg/dL según la edad y  el método utilizado.

Es conveniente no tener concentraciones de triglicéridos en exceso, pues este excedente es el primer eslabón en las alteraciones lipoproteicas que originan una de las principales causas de muerte con sus manifestaciones cardiovasculares.

Dianas de trigliceridos:

Existen algunas sustancias no glicéridas que pueden añadirse a la medición de triglicéridos  como ocurre con el glicerol libre, por ejemplo.  El glicerol está normalmente en el plasmaa en concentraciones inferiores a 1.5 mg/dl, pero puede aumentar en diabéticos no controlados, tras un ejercicio vigoroso.  Tras la ingesta de algunos medicamentos que contienen glicerol o por contaminación casual con el glicerol utilizado como lubricante en los tapones de algunos tubos de ensayo.

En el plasma o suero frescos están generalmente presentes glicéridos parciales en muy baja concentración, pero pueden formarse por la hidrólisis lenta de los triglicéridos cuando se almacenan las muestras.

Afortunadamente el problema de las dianas suele ser de poca importancia práctica y,  rutinariamente no se determinan en los laboratorios debido a que la magnitud de las dianas encontradas en la mayoría de las muestras frescas es alrededor de 5 mg/dL.